线粒体肌病的诊断依赖于典型的临床症状：四肢近端极度不能耐受疲劳，身体矮小和神经性耳聋等，伴各亚型临床特征;血清乳酸，丙酮酸增高和肌肉活组织检查发现RRF，mtDNA缺失或点突变等之结果，线粒体脑肌病患者CT或MRI检查可见白质脑病，基底核钙化，脑软化，脑萎缩和脑室扩大等。
但应注意炎症肌病和其他肌病可同时伴存线粒体和糖原堆积之可能，严防过多过滥诊断线粒体肌病。
线粒体肌病需与多发性肌炎，重症肌无力，周期性瘫痪和眼咽型进行性肌营养不良等鉴别。
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