白血病微小残留病检查报告单-白血病微小残留病检查什么项目-白血病微小残留病检查费用多少钱-第1页-家庭医生在线

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白血病微小残留病的诊断

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　　1.检测方法：对白血病微小残留病检测方法有多种，各有其优点和缺点分别基于不同的检测水平：①细胞整体水平，形态学方法;②细胞表面、胞质、胞核标志;③染色体及DNA/RNA水平。因白血病患者异质性很大，应根据患者特点选择相应的手段或综合几种方法以提高检出率。

　　1.1.免疫双标记法免疫学标记法的依据是：①白血病细胞与正常细胞所表达抗原量存在差异;②白血病细胞出现异常抗原表型(抗原异位分布)。不同系列及不同分化阶段的ALL抗原表达谱不同，据此选择双标记方法，对不同ALL的MRD进行检测。检测T-ALL的MIRD常选择TdT加T系有关相关抗原为标记。通常95%以上的T-ALL具有TdT和T系抗原双标记，如果T- ALL患者临床完全缓解后，骨髓或外周血中检测到TdT阳性伴CD5、CD3、CD1、TCRa或β等抗原中一项以上阳性，即可诊断为MRD。常用TdT/CD10作为双标记检测B-ALL的MRD，TdT/CD19、TdT/CD22、TdT/Cyμ(胞质免疫球蛋白μ重链)等亦常用。使用这些标记可覆盖30%B-ALL,另外10%～20%的前B-ALL表达一个髓系标志，这部分患者用TdT/CD13、TdT/CD14或TdT/CD33等来检测白血病微小残留病。

　　采用免疫双标记法检测MRD的敏感度在T-ALL为10^-4～10^-5，B-ALL，为10^-3～10^-4。其优点是：①特异性较强;②可比形态学指标提前6个月预测白血病复发;③方法相对简单，费用较少。其局限性是：①在B-ALL中检测范围受限;②少数患者可因白血病细胞表型改变导致假阴性;③由于白血病细胞在骨髓分布的异质性及血一髓屏障作用，单个部位骨髓标本及外周血标本不一定代表全身骨髓内的真实情况。

　　1.2.白血病微小残留病的细胞遗传学检查

　　1.2.1.流式细胞仪核型检测：此法的主要原理是应用能与DNA中的C-G或A-T碱基对特异结合的荧光染料对悬液中的染色体进行双荧光标记，然后在流式细胞仪上作核型分析，根据染色体DNA中C-G和A-T含量差异来鉴定细胞基因异常。此法能在数秒钟内分析数千个染色体，同时还可将异常染色体分离出来作迸一步分析，其敏感性达10^-2，提高了临床实用性。缺点是不能对白血病细胞精确定量，分辨率也比分带技术低。

　　1.2.2.荧光原位杂交技术(FISH):此法是用生物素、地戈辛配基等半抗原标记的DNA探针与相应的染色体原位杂交，然后通过间接荧光技术在染色体上检测特异的DNA。优点是：①对分裂期和间期的细胞均能够检测，不必体外培养等复杂过程;②能在单个细胞水平研究染色体，结果直观可靠，特异性强，且能定量;③分辨异常的能力较常规染色体技术高，敏感度达10^-2～10^-3水平;④如采用多指标分析FISH技术，可进一步提高敏感性，增加MRD的检测范围。缺点是：①目前可供FISH用的探针种类尚不多，应用范围受限;②可出现假阳性和假阴性。

　　1.3.聚合酶链反应(PCR)技术：利用PCR技术能在体外快速而特异地扩增含有特定的核苷酸序列的微量DNA的原理，根据白血病微小残留病患者几乎都有特异性分子标记(抗原受体基因重排、染色体易位所致融合基因重排或缺失、原癌基因点突变等)的特点，通过设计特异性引物，可以敏感、特异地检测ALL的MRD。

　　1.3.1.抗原受体基因重排：目前用于ALL的MRD检测的抗原受体基因重排主要有免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体(TCR)基因。

　　利用抗原受体基因检测ALL的MRD目前通常有二种方法：①特异寡核苷酸探针方法：此法敏感性和特异性均较高，是较理想方法。但过程较复杂、费时长，费用亦相对较高，限制了它的推广应用。②通用引物方法：IgH可变区有3个互补决定区，即CDRⅠ、CDRⅡ、CDRⅢ，其中只有CDRⅢ包含D片段，代表整个VH-D-JH重排的大部分信息。因此，常用IgH的CDRⅢ重排片段检测MRD。

　　TCR基因分为α、β，γ、δ四种，分别编码TCRα/β和TCRγ/β受体复合物。TCRγ、δ基因因其胚胎型编码基因少，连接区的多样性.较适合MRD的检测。虽然TCRγ、δ的基因重排同样出现高度多样化，但这种重排仍保留着充分的保守序列。利用这些保守序列，仍可设计通用引物来进行PCR检测。文献报告，IgH、TCRδ、TCRγ基因重排阳性率在B系ALL分别为95%、54%、55%左右，在T系ALL则分别为14%、68%、91%。此法主要缺点是由于引物匹配性、反向重排、不完全重排、克隆演化的原因造成的假阴性现象。

　　1.3.2.特异性融合基因产物：ALL患者几乎都伴有染色体易位(融合基因)，基因的重排、突变或缺失，这些改变可为MRD检测提供特异的分子标记。

　　PCR法检测正常人骨髓及外周血细胞的重排是多克隆的，重排片段长短不一，电泳后模糊一片，而肿瘤细胞则可见特异性窄带。不同肿瘤细胞的基因重排方式不同，表现在PCR扩增后产物的电泳位置不同。PCR检测白血病微小残留病灵敏度高达10^-5～10^-6，特异性强。但需注意出现以下二种情况：①假阳性：以下情况可呈假阳性：污染;死亡细胞或白血病细胞碎片的DNA序列被扩增。②假阴性：诊断时多种重排的亚克隆;克隆演化;标本取材错误(髓外组织);白血病呈灶性分布，化疗后MRD分布亦不均匀，取材未获病灶;MDR<10^-5～10^-6，PCR法不能检测出。

　　2.临床意义：白血病微小残留病检测对及早预测复发，早期检测产生耐药的白血病克隆、检测治疗反应及研究复发机制有意义。目前趋向应用PCR技术检测多种特异性基因标志(IgH基因，TCR基因重排及肿瘤特征标志)。小儿ALL的MRD检出率高达96%。

　　2.1.监测治疗反应及复发使白血病治疗个体化

　　许多资料表明：在ALL临床缓解早期(<6个月)，约70% ALL患者的骨髓或外周血标本白血病微小残留病阳性;治疗中后期(7～24个月)，约40%患者MRD阳性，在治疗末期(疗程结束，通常3～5年)，仅2%患者MRD阳性。CR后7～19个月仍阳性不预示复发，仅代表MRD从骨髓中清除的过程;维持治疗的后期或停药后，若白血病微小残留病持续阳性，或由阴性转为阳性，或残留细胞逐渐增多时，可作为复发信号，通常比骨髓形态学提早2～6个月提示复发。一般第1次MRD阳性到复发的中位时间为150天;MRD持续阴性或残留细胞数逐渐减少者提示预后较好。此结果提示，缓解后白血病细胞并未完全消除，坚持维持治疗对进一步消除残留的白血病细胞、减少复发具有重要作用。美国Jude儿童研究医院认为当联合使用流式细胞仪检测异常的免疫表型及用PCR技术分析克隆性抗原受体基因重排情况，可检测所有ALL忠儿的白血病微小残留病，获得免疫学或分子生物学缓解的患儿(即在诱导缓解治疗结束时骨髓有核细胞中仅有<0. 01%的白血病细胞)较单根据原始细胞形态学标准而确定缓解者的临床预后为好，在诱导缓解治疗结束时，MRD水平在10-2者，其预后几乎与骨髓内有5%原始细胞者一样诱导失败。诱导结束时MRD阳性的患者5年累计复发率为43%±11%.而阴性患者为10%士3%，诱导结束时和持续治疗14周MRD阳性患者累计4年复发率为68%士16%，而14周时阴性患者复发率为7%±7%。因此MRD的监测可提供与化疗相应的白血病细胞数，可用于改进儿童ALL的预后评价和治疗选择。

　　2.2.克隆演化初治时存在的重排或免疫标记在疾病的发展过程中改变了重排方式，免疫标志消失或增加称克隆演化。在IgH重排中发生率50%，TCR中发生率20%，IgH重排的不稳定性随时间的延长而增加，3年内复发者仅1/7 m现新的重排，3年后则达4/5。此外15%～45%患者初诊时有2种以上的重排，称寡克隆性。前者可导致MRD假阴性。

　　2.3.脑脊液白血病微小残留病的检测及其临床意义髓外白血病是造成白血病复发和死亡的主要原因之一，其中中枢神经系统白血病(CNSL)是最常见的髓外白血病。传统的CNSL诊断标准尚不够敏感，但日前常用的定性PCR方法1次脑脊液MRD阳性暂时还不能作为CNSL的诊断标准，定量PCR方法检测CSF的MRD正在探索中。我们对13例初诊时PCR检测骨髓MRD为阳性的ALL病人进行CSF的MRD检测，结果有6例CSF的MRD阳性，追踪观察结果显示：经目前常规三联鞘注和大剂量氨甲蝶呤(HDMTX)治疗后，4例逐渐转为阴性，临床持续缓解，余下两例中，1例持续阳性.1例阴性后又转为阳性，此两例均发生CNSL。检测脑脊液的MRD观察中应防止腰椎穿刺血管损伤所致的假阳性，因此，凡腰穿过程中有损伤性出血及常规检查有红细胞的标本均不能采用。同期采集外周血标本作对照分析，可进一步帮助排除假阳性。

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